To ważny krok ku budowie tanich czujników chemicznych, identyfikujących w płynach ustrojowych nawet niewielkie stężenia białkowych markerów chorób.

Jak zamek dobrany do otwierającego go klucza
Cząsteczki wybranego związku chemicznego, nawet w bardzo małych stężeniach, można wykrywać za pomocą detektorów z matrycami polimerowymi o odpowiednio wykonanych zagłębieniach. Zagłębienia te, nazywane lukami molekularnymi, pasują bowiem tylko do cząsteczek o kształcie pierwowzoru, który wcześniej je „odcisnął” – są jak zamek dobrany do otwierającego go klucza. Wytwarzanie matryc z lukami o kształcie odpowiadającym prostym cząsteczkom nie sprawia dziś większych problemów. Kłopoty pojawiają się jednak w przypadku bardzo dużych cząsteczek, takich jak białka. Luki są wtedy tak duże, że mogą w nich utknąć także cząsteczki inne niż użyte do budowy matrycy.

– W Instytucie Chemii Fizycznej PAN udoskonaliliśmy metodę wytwarzania luk molekularnych w matrycach polimerowych w taki sposób, że z powodzeniem możemy stosować ją do wdrukowywania różnych białek. Mało tego, nasze 'chemiczne zamki' są teraz znacznie lepsze! Nie tylko mają kształty dokładniej odpowiadające odciskanym cząsteczkom, one są wręcz aktywne: określone miejsca luki 'sklejają się' elektrostatycznie z odpowiednimi fragmentami wdrukowywanej cząsteczki – mówi dr inż. Maciej Cieplak (IChF PAN).

Etapy wytwarzania matryc z lukami molekularnymi
Dotychczasowa metoda wytwarzania matryc z lukami molekularnymi składała się z kilku etapów. Najpierw wdrukowywane białka umieszczano w roztworze ze starannie dobranymi monomerami, czyli podstawowymi „cegiełkami” mogącymi tworzyć polimer, i pozwalano tym monomerom spontanicznie się ułożyć wokół cząsteczek białka. Następnie mieszaninę poddawano polimeryzacji. Na ostatnim etapie z tak powstałej, utwardzonej struktury usuwano cząsteczki-klucze.

 – Podstawowa wada tradycyjnego podejścia polega na tym, że monomery funkcyjne są dość luźno
związane z powierzchnią białka, więc znaczna ich część rozmieszcza się dość przypadkowo w całym polimerze. Luki pasują więc do cząsteczki-klucza praktycznie tylko kształtem. Dlatego czujnik zbudowany z użyciem takiej matrycy mógłby reagować na obecność związków, których cząsteczki z zupełnie przypadkowych powodów wykazywały skłonność do zaczepiania się w lukach – wyjaśnia dr Cieplak.

Metoda jeszcze bardziej dokładniejsza
Naukowcy z IChF PAN opracowali dokładniejszą metodę wdr ukowywania białek, którą zilustrowali na przykładzie albuminy. Albumina jest podstawowym składnikiem białkowym osocza krwi, gdzie odpowiada m.in. za transport niektórych substancji. Obecność albuminy w moczu świadczy o niewydolności nerek, najczęściej związanej z cukrzycą lub nadciśnieniem tętniczym.

W nowej metodzie monomery funkcyjne, przygotowane przez grupę prof. Francisa D'Souzy z University of North Texas, naukowcy z IChF PAN najpierw połączyli wiązaniami chemicznymi z cząsteczkami albuminy, po czym usunęli nadmiar monomerów. Dopiero po tym etapie dodano monomery sieciujące, roztwór spolimeryzowano, a następnie z otrzymanego polimeru usunięto cząsteczki-klucze. Tak powstałe zagłębienia molekularne były dopasowane do oryginalnych cząsteczek nie tylko kształtem, ale także rozmieszczeniem miejsc, które elektrostatycznie wiązały się z cząsteczką wzorca.

Warstwy polimerowe na złotych elektrdach
Warstwy polimerowe z lukami molekularnymi odpowiadającymi albuminie wytworzono w IChF PAN na złotych elektrodach. Pokrycia miały grubość ok. 200 nanometrów przy rozmiarach luk ok. 5 nanometrów. Jeśli w roztworze, w którym była zanurzona tak spreparowana elektroda, znajdowała się albumina, z czasem jej cząsteczki osadzały się w lukach matrycy. Prowadziło to do stosunkowo łatwej do wykrycia zmiany przepływającego prądu. Selektywność tak przeprowadzonego pomiaru była bardzo wysoka: matryca dopasowana do albuminy w jej obecności generowała sygnał co najmniej kilkukrotnie silniejszy niż w przypadku oddziaływania z innymi podobnymi białkami.

Zaleta matryc - trwałość
Ważną zaletą matryc przygotowanych nową metodą jest ich trwałość. Po przeprowadzeniu pomiaru matryce można oczyścić i wykonać pomiar ponownie. Jak wykazały testy w IChF PAN, zanim uszkodzeniu ulegnie struktura polimeru, matryce można użyć nawet kilkadziesiąt razy. – Wykrywanie albuminy, choć ważne, to tylko demonstracja metody. Najważniejsze jest to, że dysponujemy teraz narzędziem pozwalającym budować matryce z lukami dopasowanymi do praktycznie dowolnego białka. Stąd już tylko krok do konstruowania łatwo dostępnych, tanich i małych czujników wielokrotnego użytku, zdolnych reagować nawet na minimalne stężenia białkowych markerów wielu chorób, które dziś wykrywamy zbyt późno – puentuje prof. Włodzimierz Kutner (IChF PAN).

Źródło,fot.: IChF PAN